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作者：汤明辉

一． 电脑R的发展历史

电脑R技术自问世以来，在遗传病、病原体、癌基因等分子诊断领域与法医鉴定等方面发挥了巨大作用。第一代 电脑R在进行扩增后通过凝胶电泳进行定性解析。

随着生物分子荧光技术的发展，1992年实时荧光定量电脑R(Quantitative Real-time 电脑R, q电脑R) 应运而生。q电脑R是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质荧光强度来测定每次聚合酶链式反应（电脑R）循环后产物总量的方式。由于在电脑R扩增的指数时期，模板的Ct值与该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以Ct值也就成为定量的依据。基于荧光探针或染料的第二代 电脑R 技术随后逐渐发展为检测核酸目标片段的主流分子诊断学技术。

在实时定量 电脑R（q电脑R） 过程中，荧光信号随着扩增产物的积累而增强。q电脑R 能够实时获取模板扩增的荧光值，然后根据DNA 模板在指数增长时期的 Ct 值和要求 DNA 的Ct值相对来计算初始模板的浓度。但是这种方式由于是大体积反应系统，非特异性的扩增增加了假阳性结果与背景信号，因此，最终无法获取绝对定量的结果。

随着MEMS工艺的不断成熟与微流控技术的不断发展，新一代电脑R技术，数字电脑R(digital 电脑R, d电脑R) 也随之出现。digital 电脑R是一种新的绝对定量电脑R，主要是对电脑R反应物进行有限稀释，随后在不同的反应腔室里进行电脑R扩增，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数和比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。

图1. 电脑R技术的发展历程

二． 数字微流控（d电脑R）的原理

20 世纪末，Vogelstein 等提出数字电脑R( digital电脑R，d电脑R) 的概念，通过将壹个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含壹个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行电脑R 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学解析。

d电脑R是一种核酸分子绝对定量技术。

d电脑R一般包括两部分内容，即电脑R扩增与荧光定量解析。

在电脑R 扩增阶段，和传统技术不同，d电脑R一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几万个反应腔室里反应。这样子等于于变相的对靶基因进行富集。和此同时，由于对原样品的大幅度的稀释，使得电脑R抑制剂浓度显著降低，这样d电脑R对初始电脑R反应物里抑制剂的标准显著低于q电脑R。

不同于 q电脑R对每个循环进行实时荧光测定的方式，d电脑R 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数和比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

图2. d电脑R基本原理

三. d电脑R和q电脑R的对比

比较于荧光定量电脑R（q电脑R）而言，d电脑R具备以下优势：

1、 灵敏度可达单个核酸分子：检测限低至0.001%，原因在于d电脑R可以实现靶标DNA/RNA的富集；

图3. d电脑R可以实现痕量核酸的高灵敏检测

2、 无需要求品（要求曲线），即可对靶分子起始量进行绝对定量；

3、 非常适合基质复杂样品的检测：终点电脑R检测，不依赖Ct值，不依赖扩增效率，能克服电脑R抑制剂的影响，适合动血样、FFPE组织、粪便、尿液、痰液、水样、土壤、植物等复杂样品中DNA的绝对定量；

4、 能够有效区分浓度差别（变化）微小的样品：更好的准确度、精密度与重复性，可以用于精确测定靶基因的比较表达，基因拷贝数变异解析等。

图4. q电脑R与d电脑R的对比

四．d电脑R的多指标检测的实现

如同q电脑R一样，d电脑R中实现多指标的并行检测能显著降低检测成本，获得更丰富的检测信息。

不同于q电脑R中的多腔室扩增和多荧光通道结合的并行电脑R方法，在d电脑R里，壹个微反应腔室里一般只含一种靶基因。

图5. d电脑R的多指标并行检测的实现方法

所以d电脑R的多指标检测主要通过以下两种方法实现：

1. 多个荧光通道。运用多种荧光染料来标记不同的要检测的靶基因。

2. 单波长多强度。运用一种荧光染料，但是扩增结束时不同的靶基因对应的染料的荧光强度不一样。

五．d电脑R的分类以及相关的产品

微流控芯片技术能够快速并准确地将样品流体分成若干个独立的单元, 从而进行多步平行反应，并且具有成本低、体积小与高通量等特征，是理想的数字电脑R平台。按照其独立的单元的实现方法来细分，d电脑R又分为基于液滴微流控（droplet microfluidics）的微滴数字电脑R（droplet digital 电脑R, dd电脑R）与基于芯片式微流控的微阵列芯片式电脑R。

5.1微滴数字电脑R（droplet digital 电脑R, dd电脑R）

微滴数字电脑R主要是将两种互不相溶的液体，以其中一种作为连续相（油），另一种作为分散相（水），在水/油两相表面张力与剪切共同作用下分散相以微小体积单元的形式存在于连续中，从而成液滴。这种液滴式的反应腔室具有体积小、样品间无扩散等优势。

在dd电脑R中，利用微滴发生器可以一次生成数万乃至百万个纳升甚至皮更新别的单个油包水微滴，作为数字 电脑R 的样品分散载体。这里，液滴中包裹了单拷贝DNA模板与电脑R反应液，然后将液滴收集在电脑R反应管中进行扩增。Ø电脑R反应结束后检测每个微滴的荧光信号。

目前Bio-Rad企业的QX100系统、QX200系统均为采用液滴技术的数字电脑R系统。

图6. Bio-Rad的droplet digital 电脑R系统

5.2 微阵列芯片式电脑R

微阵列芯片式电脑R主要通过芯片设计将纳升液体封闭在高通量的微池或微量通道中进行后续的电脑R扩增及扩增后结果的荧光显微镜直接判读。

按芯片设计方法，微阵列芯片式电脑R又可以分为阵列微池式芯片、滑片式芯片与集成微泵阀芯片：

1. 阵列微池式芯片上刻蚀有微池阵列，反应液由进样孔直接导入个反应微池；

2. 滑片式芯片是设计带有微流体通道与反应单元的玻璃芯片，上下两篇玻璃芯片间用油相密封，通过滑动芯片将样品溶液从液体通道引入反应单元，同时生成成百上千个微反应滴阵列；

3. 集成微泵阀式芯片是通过多层软刻蚀技术在聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片上加工交织的液体与气体通道结构，通过精确地控制微泵阀的开启与关闭，快速并准确地将流体分成若干个阵列的独立单元。

2010年，Life Technologies也推出了基于阵列微池式芯片的数字电脑R产品线–OpenArray系统。它提供的TaqMan OpenArray 数字电脑R试剂盒可在OpenArray平板上运行。平板可在现有的OpenArray 实时定量电脑R系统以及新上市的QuantStudio™ 12K Flex仪器上运行。OpenArray 实时定量电脑R系统能够同时运行3块OpenArray平板。

图7. TaqMan® OpenArray® Digital 电脑R系统

Fluidigm企业于2006年底推出了基于集成流体通路（IFC）芯片的Bio-Mark™ 高通量基因剖析系统。

其创新在于集成液体通路技术：应用集成电路制造工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻上许多微管与微腔体，经过不同的控制阀门控制溶液在其中的活动主题来完成生物样品的分液、混合、电脑R扩增。

图8. Bio -Mark™ IFC芯片

六．d电脑R的应用前景

6.1 痕量核酸检测

图 9. 痕量核酸检测的具体分类

d电脑R尤其适合：对灵敏度标准特别高的核酸痕量解析研究；基质复杂样品中的核酸准确定量（如组织、体液、排泄物等样品）。

图10. 痕量核酸检测相关方式相对

6.1.1 癌症标志物稀有突变检测

在一份向定的样本中，相比于野生型DNA，癌症相关的突变序列比例较低，经常无法检测。而凭借其超高灵敏度，d电脑R系统可以很容易地定量解析低至0.001%-0.0001%的突变频率。之前用任何方式都无法实现准确稳定检测的样本，今年可以运用d电脑R轻松进行定量解析。

是否能够开发出有效的靶给治疗药物，和突变基因的检测密切相关。其中（1）携带药物作用突变位点的癌细胞百分比；（2）突变的特定等位基因是否可以被准确检测到，这两点都直接影响到靶给治疗是否有效。很显然，在肿瘤均质细胞内检测单一突变比较简单，但是如果在异质组织内，在仅存有少量突变存在的情况下，怎么准确检测出突变/稀有变异，或者针对于同一种癌症中多种亚克隆的准确鉴定，对个性化医疗的发展是壹个巨大的挑战。

案列1. 实现肺癌相关的表皮生长因子受体（EGFR）中T790M突变的检测，可以更好地评估抗酪氨酸激酶抑制剂的治疗。然而，由于其他技术检测灵敏度有限，无法在高背景EGFR野生型中可靠地检测到T790M突变。研究人员运用d电脑R技术开发出精确度很高的检测方式，以准确定量T790M的浓度[1]。

图11. dd电脑R可以用EGFR突变的肺癌患者的血浆中游离DNA（cfDNA）为样本，检测和EGFR敏感性与药物抗性相关的突变

6.1.2 致病微生物检测

精确的病毒载量解析对于阐释疾病病程，后续治疗及疗效评估是至关重要的。病毒载量的波动，即使只下降了特别低的水平，意义却是显著的。在对病原体的研究中，能不能实现准确而可靠的病毒DNA或RNA定量解析，关系到实验的成败。

案列2. 研究人员相对了 q电脑R 与 d电脑R 方式检测临床样本中残留的人类免疫缺陷病毒（HIV），其中包括功能性治愈的HIV感染婴儿。研究人员发现，在检测百万个细胞内的 HIV DNA拷贝数时，相比于 q电脑R，d电脑R 的灵敏度提高了5倍；在检测病毒长末端重复序列时，d电脑R比q电脑R灵敏提高了20倍[2]。

案列3. 研究人员寻觅HBV血清学与dd电脑R检测结果和肝细胞癌（HCC）临床分期与病症之间的关系中，dd电脑R成功的克服了real-time 电脑R（q电脑R）在检测FFPE处理的肝癌患者组织样品中HBV DNA时，遇到的准确度、灵敏度与重复性不足的缺点。进而得出以下结论： 1、dd电脑R的灵敏度与准确度比real-time 电脑R更高——131个待测样品中HBV DNA浓度范围为1.1~175.5 copies/ul； 2、即使是在24个血清学检测呈阴性的样本中也检测到了痕量的HBV DNA； 3、样品中HBV DNA的含量和肝细胞癌（HCC）组织的临床分期一致； 4、dd电脑R技术可以用于肝癌的早期无创诊断，病程监控，肝移植、化疗或免疫抑制的疗效评估[3]。

6.2 和新一代测序（NGS）的无缝对接

比较于NGS， d电脑R可以富集待测序样品中的靶基因; d电脑R还可以验证 / 精确定量测序结果。

图12. dd电脑R与NGS的优势互补

案列4. 由于人间充质干细胞（MSC）在人体内的含量极低，所以目前应用于临床治疗的MSCs都来源于体外培养。研究人员分别对体外培养p1，p8与p13阶段（passage）的来源于人骨髓MSC采用全基因组测序(WGS)。WGS结果显示在p1与p8阶段的培养细胞中没有拷贝数变异（CNV）与特别低频的单核苷酸突变(SNV)，但是p13阶段的SNCs数目显著增加，达到677个。采用dd电脑R对WGS发现的8个非同义突变进行了确认，结果发今年未经培养的单核细胞内就含有极低频对应的突变(0.01%)，在p1与p8阶段培养的MSC内其突变比例依然处于极低比例状态(0.1-1%)，但是在p13培养的阶段对应突变的比例显著地上升到(17-36%)[4]。

6.3 基因表达解析

实时荧光定量电脑R 常用于检测基因表达差别，但该方式一般只能检测出两倍或者更大的差别。而一些研究则需要检测低于两倍的表达变化。d电脑R 的检测精度可达±10%甚至更高，能够分辨更小的差别。

d电脑R尤其适合：基因比较表达变化差别较小（<2倍）的研究；低丰度基因或单细胞的表达解析，以及RNA编辑、等位基因差别表达等研究。

图13. 基因表达解析相关方式相对

6.4 拷贝数变异解析

图14. 拷贝数变异

拷贝数变异 (CNV) 解析的目的是确认目的序列的拷贝数是否偏离野生型序列，以及偏差多少。拷贝数变异和疾病（癌症）、代谢路径、生物种进化等关系密切。临床上，CNV可为具体治疗方案的制定和修正提供参考；农业及畜牧业，CNV可作为遗传育种的遗传标记。

传统实时荧光定量电脑R平台提供了足够的分辨率，可以鉴别低拷贝数 (如0至5的拷贝数)；但更高的拷贝数需要更精确的测量，以确定确切的拷贝数。d电脑R尤其适用于更高拷贝数解析，检测精度超过±10%。

参考文献：

1. Oxnard G R, Paweletz C P, Kuang Y, et al. Noninvasive detection of response and resistance in EGFR-mutant lung cancer using quantitative next-generation genotyping of cell-free plasma DNA[J]. Clinical cancer research, 2014, 20(6): 1698-1705.

2. Persaud D, Gay H, Ziemniak C, et al. Absence of detectable HIV-1 viremia after treatment cessation in an infant[J]. New England Journal of Medicine, 2013, 369(19): 1828-1835.

3. Huang J T, Liu Y J, Wang J, et al. Next generation digital 电脑R measurement of hepatitis B virus copy number in formalin-fixed paraffin-embedded hepatocellular carcinoma tissue[J]. Clinical chemistry, 2015, 61(1): 290-296.

4. Cai J, Miao X, Li Y, et al. Whole-genome sequencing identifies genetic variances in culture-expanded human mesenchymal stem cells[J]. Stem cell reports, 2014, 3(2): 227-233.